Chemiluminescentie

Luminol reagens is een middel dat na in kontakt komen met bloed een reactie aangaat waarbij licht vrijkomt. De eerste publicatie waarin het werd voorgesteld als forensisch middel stamt uit 1937 [1}. Het verschijnsel dat tijdens een chemische reactie licht vrijkomt wordt chemiluminescentie (ook wel chemoluminescentie) genoemd. Wanneer een bloedvlek wordt besproeid met luminol duurt de chemiluminescentie vanaf ca. 10 seconden tot meerdere minuten. Alhoewel de intensiteit van het blauw-witte licht (piekemissie rond 455 nm [7]) niet erg hoog is, kan het wel gefotografeerd worden met lange sluitertijden. Door de bloedvlek opnieuw te besproeien met luminolreagens zal opnieuw chemiluminescentie ontstaan. Omdat het reagens bloed niet fixeert zal de vlek langzaam uitlopen, zeker na meerdere keren sproeien.

Uit de aard van het reagens en de beschrijving hierboven zal duidelijk zijn dat succesvol zoeken (en vooral fotograferen van de luminescentie) alleen in volkomen duisternis kan gebeuren. Ofwel werkt men 's nachts ofwel men moet de hele plaats delict volkomen kunnen verduisteren.

Toepassingsgebied

Luminol kan gebruikt worden voor::

• Het zoeken naar bloedsporen, als met het blote oog geen waarneembare sporen zijn. Omdat het reagens zo gevoelig is, worden ook bloedsporen die schoongemaakt zijn nog zichtbaar. Voorbeelden: woningen, garages, kofferbak van auto's.
• Vastleggen van schoensporen in bloed op tapijt, als met kleurstoffen zoals Amido Black en Hongaars rood toch geen resultaat verkregen zou kunnen worden. [2]
• Documenteren van bloedspatters op vloeren, wanden en plafonds (in dit geval bloed dat van een mes afgeslingerd wordt bijvoorbeeld).
• Het zoeken naar en volgen van bloedsporen buiten. Dit is vaak lastig te realiseren in de bebouwde kom. Een wijk en/of de straatverlichting zou van de stroom afgesloten moeten worden. In een bos of open veld zou dit minder problematisch zijn. Van luminol is bekend dat het gebruikt wordt door jagers om aangeschoten dieren op te sporen.

Formuleringen

De luminolset F-3000 (voor 1 liter gebruiksoplossing) gebruikt een recept dat al lange tijd bekend is (K. Weber, 1966) en veel gebruikt wordt. De set F-31000 (voor 0,5 liter gebruiksaanwijzing) is op basis van een geconcentreerder, Nederlands, recept dat is gepresenteerd op het SPTM congres in Stockholm in 1999 [3], het IAFS-congres datzelfde jaar in Los Angeles [4] en in Modus [5].

Dit recept is zo samengesteld dat het een sterkere chemiluminiscentie geeft dan het klassieke recept, maar dat (onvermijdelijke) degradatie van het DNA in de gevonden bloedsporen beperkt blijft.

Gebruiksaanwijzing "klassiek" recept F-30000

Deze set bestaat uit drie oplossingen (allen op waterbasis): een natriumhydroxide oplossing (oplossing A), een oplossing van luminol (3-aminophthalhydrazide / 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedion) in een licht basische oplossing (oplossing C) en een verdunde waterstofperoxide-oplossing (oplossing B). Oplossing B wordt vlak voor gebruik aangemaakt door 2 tabletten ureum-waterstofperoxide in de (meegeleverde) 100 ml gedestilleerd water. De mengverhouding is 1 deel oplossing A, 1 deel oplossing B en 1 deel oplossing C in 7 delen water (bij voorkeur gedestilleerd water, niet bij de set meegeleverd!).

Na aanmaken van de gebruiksklare oplossing is deze enige uren te gebruiken (bij kamertemperatuur; hoe lager de temperatuur, hoe langer de oplossing houdbaar is). Onder invloed van bloed, dat werkt als katalysator (versneller van een reactie), reageert de luminol met de waterstofperoxide waarbij een molecuul stikstof ontstaat en (soms) licht ontstaat. Het eindproduct is 3-aminophthaalzuur (of eigenlijk het dinatriumzout ervan gezien de hoge pH). Hoe lager de temperatuur, des te minder luminiscentie er optreedt.

De werkoplossing moet fijn verneveld worden over het te onderzoeken gebied. Omdat het bloed deels oplost in de druppeljes werkoplossing en daardoor de sporen uitlopen geeft een fijne nevel (kleine druppels) het best resultaat.

De beste verneveling wordt verkregen met spuitapparatuur zoals autospuiters die gebruiken. De aanwezigheid van perslucht of een luchtcompressor op de PD is dan wel vereist. Voor alle sproeiers geldt dat zij liefst geen of in ieder geval zo weinig mogelijk metalen onderdelen moeten bevatten (metaal en metaaloxiden katalyseren de reactie tussen luminol en waterstofperoxide).

Gebruiksaanwijzing sterke recept F-31000

Deze set bestaat eveneens uit één oplossing (bevat luminol en natriumhydroxide in water) en twee tabletten ureum-waterstofperoxide. De werkoplossing (0,5 liter) wordt gemaakt door de twee tableten op te lossen in de luminoplossoing (of één tablet in de helft van de luminoloplossing om 250 ml werkoplossing aan te maken).

Vanwege de hogere concentratie chemicaliën in deze receptuur is het nog belangrijker dan met het klassieke recept dat deze fijn verneveld wordt.

Vals positieven

Niet alleen bloed werkt katalytisch op de reactie tussen luminol en waterstofperoxide. Ook bepaalde plantenenzymen (gebroken stengels, geknut gras, beschadigde vruchten), materialen (bijv. jute en sisal, sommige verfsoorten [6] bewerkstelligen de reactie. Sommige anorganische stoffen, zoals roest en bepaalde bleekmiddelen, doen dit ook.
Uit de literatuur is bekend dat vals positieve reacties vaak onderscheidbaar zijn. Zij luminisceren meestal minder lang dan bloed en geven soms ook een wat andere kleur [7]. Het kleurverschil kan met spectrometers waargenomen worden. Met het blote oog is dat moeilijk of onmogelijk.

De resten van bleekmiddelen gebaseerd op hypochloriet (zoals bleekwater) ontleden binnen enkele dagen en geven daarna geen reactie meer met luminol. Als het vermoeden bestaat dat gebruik van bleekwater een vals positief oplevert of kan opleveren is enkele dagen wachten met het onderzoek een goede optie [10]. Een andere optie is het gebruik van de Grodsky luminolreceptuur (luminol, natriumcarbonaat, natriumperboraat in water [11]) met 0,1 mol/l 1,2-diaminoethaan (6 gram/liter) [10]. Het 1,2-diaminoethaan (beter bekend als ethyleendiamine) reageert sneller met de restanten hypochloriet dan de luminol. De lichtintenstiteit en duur van het lichtverschijnsel nemen echter ook iets af.

Om te voorkomen dat vals positief reagerende oppervlakken op DNA bemonsterd en onderzocht worden, kan getest worden op de aanwezigheid van bloed met indicatieve testen. Het NFI beveelt hiervoor de tetrabase-test [8] aan.

Fluoresceïne en luminol

Het toevoegen van een kleine hoeveelheid fluoresceïne of gereduceerd fluoresceïne (fluorescin) aan de luminol werkoplossing geeft een groene luminescentie (piekemissie ongeveer 520 nm) in plaats van een blauw-witte en zou zelfs sterker zijn dan die van luminol alleen. Met Rhodamine B wordt een paarse luminescentie verkregen (zie ook youtube.com voor demonstraties van dit verschijnsel in erlenmeyers en bekerglazen).
Zie referenties 12 voor een aantal wetenschappelijke artikelen hierover.

Vastlegging (fotografie en video)

De luminescentie van luminol kan fotografisch vastgelegd worden, waarbij een grote lensopening, hoge ISO-setting en een lange sluitertijd van de camera nodig is. Meerdere keren opsproeien (met doorlopen van de sporen tot gevolg!) zal mogelijk ook nodig zijn.

Videoopnamen kunnen ook gemaakt worden. Hiervoor is een samenbouw van een restlichtversterker en een videocamera nodig [3, 5b, 9].

Voetnoten en referenties

[1] Luminol is voor het eerst voorgesteld als detectiemiddel voor sporen in bloed door:
Sprecht, W., "Die Chemilumineszenz des Hämins, ein Hilfsmittel zur Auffindung und Erkennung forensisch wichtiger Blutspuren", Angew. Chem. 1937, Vol. 50, blz. 155-157.
De reactie die wordt verondersteld licht te geven, is het uiteenvallen van luminol (3-aminophthalhydrazide) in 3-aminophthaalzuur (3-amino-1,2-benzeendicarbonzuur) en stikstof.
[2] Overigens zou voor deze toepassing ook het met bloedsporen fluorescerende middel fluorescin (gereduceerd fluoresceïne, "leuco" fluoresceïne) gebruikt kunnen worden. Dit reagens maakt gebruik van de bloedgekatalyseerde oxidatie van het niet fluorescerende fluorescin tot het sterk fluorescerende fluoresceïne. De fluorescentie wordt opgewekt met blauw licht van een lichtbron zoals bijvoorbeeld een Polilight en bekeken en vastgelegd met een geel filter. Zie bijvoorbeeld het artikel van Renaat Develtere, laboratoriumcommissaris bij de Gerechtelijke Politie in Kortrijk, België:
Develtere, R., "Fluoresceïne, detectiemiddel voor latente bloedsporen", Modus, 2000, Vol 9, No. 4, blz. 37-39 en de daarin genoemde referenties.

PVC vloerbedekking met schoenspoor in bloed

Na behandeling met fluorescin (gereduceerd fluoresceïne).

N.B. de verneveling was niet fijn genoeg, let op de niet-fluorescerende druppels die zichtbaar zijn boven het spoor).
Vastlegging: Polilight 500 op vol vermogen (afstand uiteinde lichtgeleider tot spoor ca. 1 meter, onder een hoek van 30 graden) met gedowntuned 450 nm licht, geel filter voor de lens van de camera, sluitertijd ca. 2 seconden.
[3] Eversdijk, M.; Gelderman, R., "Shedding Fresh Light at the Scene of The Crime", Information Bulletin for Shoeprint/Toolmark Examiners 2000, Vol. 6, nr. 1, blz. 11-17 (artikel van hun lezing gegeven op 4 juni 1999 in Stockholm, SP/TM-congres).
[4] Eikelenboom, R.; Kloosterman, A. "Luminol revisited"; lezing op IAFS-congres augustus 1999. Voor een samenvatting zie ook: Information Bulletin for Shoeprint/Toolmark Examiners 2000, Vol. 6, nr. 2, blz. 24-25 (publicatie van de Marks Working Group van de ENFSI).
[5a] Eikelenboom, R.; Kloosterman, A., "Luminol herbelicht", Modus, 1999, jaargang 8, nr. 4, blz. 23-27.
[5b] Eversdijk, M.; Gelderman, R., "Nieuw licht op plaats delict", Modus, 1999, jaargang 8, nr. 4, blz. 28-30.
[6] Quickenden, T.I.; Creamer, J.I., "A study of common interferences with the forensic luminol test for blood" Luminescence, 2001, Vol. 16, nr. 4, blz. 295-298. DOI: 0.1002/bio.657
[7] Quickenden, T.I.; Cooper, P.D., "Increasing the specifity of the forensic luminol test for blood" Luminescence, 2001, Vol. 16, nr. 3, blz. 251-253. DOI: 10.1002/bio.635
[8] De tetrabase-test maakt gebruik van twee oplossingen, die na aanmaken maar 1 maand gebruikt mogen worden: 0,5 g tetrabase (N,N,N',N'-tetramethyl-4,4'-diamino-diphenylmethaan; CAS-Nr. [101-61-1]) in 10%-ige azijnzuur en 5 g bariumperoxide (BaO₂) in 10%-ige azijnzuur. De tetrabase wordt opgelost in 10 ml geconcentreerd azijnzuur en dan verdund met 90 ml gedestilleerd water. De bariumperoxide wordt opgelost in een mengsel van 10 ml geconcentreerd azijnzuur en 90 ml gedestilleerd water (duurt ongeveer een half uur onder roeren). Het aanmaken en gebruik werd beschreven in Forensisch-Technische Norm (FT-Norm) 251.01.
Vouw een rond filtreerpapier twee keer (zodat een kwart cirkel overblijft) en wrijf met de punt over de te onderzoeken vlek. Vouw dan het filtreerpapier open en breng een druppel tetrabaseoplossing aan op de punt. Vervolgens een druppel van de bariumuperoxideoplssing waarna ommiddellijk een blauwe kleur ontstaat in het geval van bloed.
WAARSCHUWING: tetrabase is geclassificeerd als een stof die als kankerverwekkend moet worden beschouwd (Categorie 1B) dus het aanmaken van de oplossing moet in een zuurkast gebeuren en contact met de stof moet vermeden worden.
[9] Shirk, S.A., "Night Vision Video and Luminol", Journal of Forensic Identification, 1995, Vol. 45, No. 5, blz. 513-514.
[10] Kent, E.J.M.; Douglas, A.E.; Miskelly, G.M., "Inhibition of Bleach-Induced Luminol Chemiluminescence", Journal of Forensic Sciences, 2003, Vol. 48, No. 1, p. 66-67. DOI: 10.1520/JFS2002105
[11] Grodsky luminol-formulering: 1 g luminol, 50 g Na₂CO₃, 7 g NaBO₃.4H₂O (natriumperboraat) in 1 liter gedestilleerd water. Grodsky, M., Wright, K., Kirk, P.L. "Simplified preliminary blood testing. An improved technique and a comparative study of methods.", The Journal of Criminal Law, Criminology, and Police Science, 1951, Vol. 42, nr. 1, blz. 95-104. DOI: 10.2307/1140307
[12a] Kalkar, C.D.; Doshi, S.V.; Madhuri Pendse, "Aqualuminescence of alkaline luminol in the presence of fluorescein" International Journal of Radiation Applications and Instrumentation. Part A. Applied Radiation and Isotopes, 1986, Vol. 37, nr. 1, blz. 41-45. DOI: 10.1016/0883-2889(86)90194-2
[12b] Navas Díaz, A; González García, JA; Lovillo, J. "Enhancer effect of fluorescein on the luminol-H2O2-horseradish peroxidase chemiluminescence: energy transfer process.", J. Biolumin. Chemilumin., 1997, Vol. 12, No. 4, p. 199-205. DOI: 10.1002/(SICI)1099-1271(199707/08)12:4<199::AID-BIO445>3.0.CO;2-U
[12c] Voicescu, M., Vasilescu, M., Meghea, A., "Energy Transfer from the Aminophthalate Dianion to Fluorescein", Journal of Fluorescence, 2000, Vol. 10, nr. 3, blz. 229-229. DOI: 10.1023/A:1009420320833

Ontleding van luminol onder invloed van waterstofperoxide en bloed als katalysator.

Fluoresceïne (fluoresceert onder blauw licht) aan de linker-, gereduceerd fluoresceïne [fluorescin] (fluoresceert niet) aan de rechterkant.